噬菌体计数与检测方法

由于抗生素滥用及过度使用，导致细菌耐药形势日益严峻。噬菌体作为感染细菌的病毒，能够特异性的杀灭耐药细菌，使得噬菌体治疗重新进入人们的视野。一方面，为了有效评估噬菌体临床治疗的结果、揭示微生物群落的复杂动态，需要精确的方法来计数和检测噬菌体颗粒；另一方面，噬菌体计数也是生产和开发以噬菌体为基础的产品、检测细菌感染和食品生物防治所必需的。根据检测对象的不同（感染性噬菌体、全噬菌体颗粒、核酸和蛋白质），本周为大家简单介绍一些当前主要使用的噬菌体计数和检测方法。
01   感染性噬菌体检测方法
噬菌斑计数被认为是噬菌体计数的金标准。双琼脂覆盖试验（DLA）允许在含有两层琼脂的受限环境（培养皿）中进行局部噬菌体与宿主细菌的接触。其中，底层为含有1%-1.5%琼脂的培养基以支持细菌生长，顶层含有相同的培养基，但琼脂浓度较低（0.4%至0.6%），通常被称为软琼脂。将顶层与宿主细菌混合后倒在底层上，形成所谓的草坪，再将含有噬菌体的样品添加在顶层，干燥；或者噬菌体和宿主细菌孵育后与顶层混合，倒在底层上，然后在细菌生长的最佳温度和时间下培养。如果噬菌体能够感染被测细菌，则草坪上会出现清晰的斑点或斑块。单个菌斑是最初一个噬菌体裂解一个宿主细菌，然后后代噬菌体杀死邻近细菌的结果。噬菌体原种或样本中感染性噬菌体的浓度（即滴度）可以通过在草坪上点样稀释的样本来确定，滴度用菌斑形成单位（PFU，类似于菌落形成单位）表示（见图1）。
02   全噬菌体颗粒检测方法
透射电子显微镜（TEM）使用电子束产生的分辨率比传统光学显微镜高1000倍，提高分辨率（降到0.2 nm）足以观察到病毒。尽管样本高度浓缩（10^6个颗粒/毫升）才能产生可靠的结果，但这项技术可以用来量化病毒颗粒。用透射电子显微镜进行病毒定量在确定病毒形态类型和总数方面具有很高的准确性，但是当运行多个样品时，该技术耗时、昂贵，而且不能用于复杂的样本。此外，样品的制备也很繁琐，而且需要熟练的操作人员来操作复杂的仪器。
另一种计数整个噬菌体颗粒的技术是流式细胞术。在本项技术中，病毒颗粒被荧光染料标记并被引导通过毛细管。毛细管的直径小，迫使颗粒以单线流动，从而可以检测由每个病毒颗粒引起的光散射。该方法快速且严谨，因此得到了广泛应用。值得注意的是，荧光信号与基因组大小无关，但混合样本中的不同病毒可以根据他们的荧光和侧向散射分布区来区分。
由NanoSight Limited公司开发的一种基于激光的方法可以实时可视化，基于激光照明光学显微镜的动态光散射在几分钟内便可以计数病毒颗粒。但该技术需要相对较高的样品浓度（10^7-10^9 PFU / ml）和清澈的液体，对于土壤和粪便等复杂的样本很难获得符合标准的样品。
03   噬菌体核酸和蛋白质检测方法
聚合酶链式反应（PCR）是一种简单而可靠的方法，它以核酸检测为基础，能比噬菌斑测定更快地验证噬菌体的存在。通过应用随机扩增多态性DNA (RAPD) PCR还可以在几小时内区分出不同的噬菌体谱系，而不需要进行全基因组测序。然而，由于噬菌体中没有普遍存在的标志性基因（如细菌中的16S rRNA基因），因此设计针对整个噬菌体多样性的引物很麻烦。PCR的另一个缺点是结果不可量化，因为该反应具有终点特征。随着该领域的进步，开发了定量PCR（qPCR）。类似地，蛋白质检测领域也迅速发展，液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS）可用于精确检测和计数未知样品中的多肽。
嵌入荧光染料的发现使人们能够测量每个PCR循环后聚合的DNA产物的量，即定量聚合酶链式反应（qPCR）方法。荧光由热循环仪记录，能够一步扩增核酸并检测荧光。计算初始DNA浓度时，可以将标准用作参考。整个qPCR平台中使用了两种基本化学成分：第一种是嵌入荧光DNA染料，第二种是通过探针、附加的带有荧光染料和猝灭剂分子的短DNA片段进行操作。对于双链DNA的定量，嵌入染料的使用选择性比较低，使用荧光标记的探针更精确，因为只有在所有三个DNA片段（正向引物，反向引物和探针）成功杂交并随后聚合后才能产生信号，这两种方法已广泛用于噬菌体生物学。
在液滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）中，将样品与疏水性物质混合形成水油乳状液，反应在每个液滴中同时进行。将混合物通过荧光检测器来计数在总液滴数量上发生放大的液滴数量。这与样品中模板DNA的数量成比例，因此无需外部标准就可以用于计算初始浓度。
全基因组测序（WGS）不需要预先分离，即可通过生物信息学分析对完整的噬菌体基因组进行测序和组装。Illumina测序技术通常用于识别新的噬菌体，还可以检测来自不同栖息地的病毒，但是它们并没有针对计数进行优化。一些关于丰度的信息可能会被从组装的重叠群的数量中提取出来，从而提供半定量数据。但是在重叠群组装过程中数据的丢失，可能会导致样本中噬菌体的数量被低估。此外，细菌宿主DNA的携带、缺乏参考噬菌体基因组的数据库以及噬菌体基因组的镶嵌性质使得病毒全基因组测序作为一种计数和检测方法具有一定的挑战性，除非事先知道序列。
04   复杂样品中噬菌体的定量
对复杂样本（例如临床样本、粪便或食物）中的噬菌体进行计数和检测，由于可能影响结果的化学化合物的存在，需要进行特殊处理。如果要从复杂样品中定量单个噬菌体，必须先了解噬菌体及其宿主，以便对它们的动力学有一个完整的了解。相反，如果我们的目标是量化整个噬菌体种群，那么我们的挑战就是去除抑制物。通常，起始的离心步骤会去除较大的颗粒，然后使用聚四氟乙烯膜过滤器（孔径为0.22 mm-0.45 mm）过滤，滤液中会富含病毒颗粒。使用聚乙二醇浓缩滤液以获得高浓度的病毒悬浮液，以进行计数和检测，如使用DLA。此外，基于PCR的方法，在病毒核酸分离之前应进行物理分离，以最大程度地减少PCR抑制剂的残留。使用全基因组测序对复杂样品中的噬菌体进行计数时，一个重要步骤是对读数进行过滤，以去除可能干扰后续分析的非病毒序列。总之，在处理复杂样品时，选择合适的预处理方法、下游方法对获得关于噬菌体浓度的综合结果很重要。
近年来，随着噬菌体在临床上治疗细菌感染、在食品中进行生物控制的广泛应用，使得对在复杂样品中进行噬菌体计数和检测的方法的需求越来越大。最广泛使用的选择是DLA方法，因为它在测定感染性噬菌体计数方面具有快速、廉价和准确的优点。同时，几种分子生物学技术提高了速度和可重复性，但是这些方法不能区分感染和缺陷的病毒颗粒，因此得出的结果很难与传统的DLA空斑分析进行比较。分子和噬菌体生物学的改进可以将当前使用的计数和检测方法的优点结合起来，而这将有助于开发新的计数和检测方法。