抗菌新策略：基于噬菌体的靶标发现及其对新型抗菌分子的开发

自1928年发现并在1940年代开发用于临床以来，抗生素已经挽救了数百万人的生命，并在无数重要的医疗程序中根深蒂固。然而，正是由于临床上抗生素的过度使用，抗菌药物耐药性在全球范围内日渐增长，并且严重危及临床治疗效果。
目前抗生素开发的局限性威胁到治疗细菌感染的长期能力。在过去的20年中，只有少数几类新的抗生素被发现并被批准用于临床试验。这是由于中小型企业通常采用基于现有分子化学修饰的传统研发策略进行抗菌开发。此外，目前抗生素的临床研发管道主要集中在已知抗生素的组合上，因此只有有限数量的抗菌靶标正在被开发[1]。大多数抗生素对各种细菌具有广谱活性，如果使用不当不仅会加剧耐药性的发展，还会对共生细菌如肠道微生物产生负面影响。因此，迫切需要加速开发新的抗菌药物，找到不易产生耐药性并以更具体的方式发挥作用的新型抗菌靶点。
来自比利时基因技术实验室的研究人员在current opinion in biotechnology期刊上发表了一篇题为“Phage-based target discovery and its exploitation towards novel antibacterial molecules”的论文。在这篇综述中，作者提出了一种综合的噬菌体驱动策略，即通过噬菌体-细菌的相互作用来揭示新的抗菌靶点。这种策略将能够设计出模拟抑制性噬菌体蛋白的小分子，并允许随后开发这些抗菌化合物。不同于噬菌体疗法和基于噬菌体酶的抗微生物剂，这种方法可能产生更可持续的新一代新抗生素，这些抗生素利用新的细菌靶标并以病原体特异性方式起作用[2]。
噬菌体和细菌之间的相互作用是由它们紧密交织的共同进化历史驱动的。在整个进化过程中，噬菌体在裂解感染周期中不断适应以在军备竞赛中对抗它们的细菌宿主。噬菌体使用复杂的分子机制来劫持细菌细胞代谢以产生后代病毒颗粒。这种密切的关系导致了高度特异性和进化优化的分子相互作用的出现，因此代表了识别新的潜在抗菌靶点的独特来源。
随着高通量基因组测序的进步，研究者已经对数以万计的噬菌体基因组进行了测序。噬菌体基因组大小从2.3kb到735kb不等，它们编码精确的信息以改变宿主细菌中的DNA复制、RNA转录、细胞分裂和蛋白质翻译途径。然而，由于与已知蛋白质缺乏同源性以及实验证据的滞后，大约一半到三分之二的噬菌体基因产物仅被注释为功能未知的假设蛋白质。这些假设蛋白质中的大多数在噬菌体感染的早期阶段表达，表明它们在宿主代谢中具有重要作用。研究这些噬菌体假设蛋白的功能，尤其是那些对宿主生长有不利影响的蛋白质，不仅可以为噬菌体生物学提供更详细的见解，而且更重要的是或许还能增加对噬菌体感染过程中细菌重编程的了解[3,4]。
受噬菌体启发的抗菌靶点发现
从噬菌体研究中揭示新的细菌靶点可以激发新型小分子化合物的筛选和设计，这些化合物模拟了噬菌体蛋白的生长抑制作用。2004年噬菌体衍生的抗菌靶点首次被发现。研究人员从26个金黄色葡萄球菌噬菌体的基因组中发现31个多肽家族对宿主表现出毒性[5]。其中一种基因产物是来自金黄色葡萄球菌噬菌体77的ORF104，它与宿主DNA复制中的一种必需蛋白质解旋酶装载物 (DnaI) 相互作用。作为一个新的靶点，DnaI和ORF104之间的相互作用随后被用于时间分辨荧光(TR-FRET) 以筛选小分子抑制剂。最后，在125000个经过筛选的小分子中，有36个可以中断DnaI和ORF104之间的分子相互作用，其中11个在合理的MIC (≤16 mg/ml)下对金黄色葡萄球菌具有直接活性。
尽管这种针对噬菌体蛋白及小分子盲筛的方法是从金黄色葡萄球菌中发现的，其原理启发了其他研究者从噬菌体中寻找新的分子靶标。除革兰氏阳性金黄色葡萄球菌外，该筛查技术已应用于马红球菌、耻垢分枝杆菌以及包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和肺炎克雷伯菌在内的一些革兰氏阴性病原体。作者在本项研究中，想要扩展这种基于噬菌体的原始靶标发现策略，以更全面的方式识别和利用新的抗菌靶标进行药物发现。该策略由两种互补方法驱动：一是“噬菌体基因组驱动筛选”，即从已知的有毒噬菌体蛋白开始，引导发现靶点；二是 “细菌靶点驱动筛选”，即以识别针对已知假定细菌靶标的噬菌体编码抑制剂。在确认这些相互作用后，这些方法趋向于设计或筛选用于临床前开发的小模拟分子（图1）。
噬菌体基因组驱动筛选
由于噬菌体基因组注释中假设蛋白质非常丰富，因此在功能未知的“早期”假设蛋白质中寻找具有新靶点的杀菌多肽是合理的。从噬菌体基因组中筛选单个假设基因是一个耗时且费力的过程。因此，仔细选择测试池可以减少工作量并最大限度地提高鉴定抗菌噬菌体蛋白的效率。除了消除编码已知功能的蛋白质（包括结构蛋白）和具有预测跨膜结构域的蛋白质的基因外，关注小基因和早期基因显着降低了噬菌体基因筛选的工作量。事实上，大多数报道的噬菌体-宿主相互作用发生在感染的早期阶段，并且涉及小的噬菌体蛋白（250个氨基酸）。或者，可以使用具有随机噬菌体基因组片段而不是单个基因的文库，从而跳过单个基因克隆的繁琐步骤。
为了检测假设的噬菌体蛋白引起的生长抑制，需要使用高通量方法来缩短筛选过程，因此作者开发了一种基于高通量测序的筛选方法。在用LC-MS/MS消除噬菌体颗粒相关蛋白后，所有“真实”假设的噬菌体基因片段都连接到高拷贝载体pU11L4上，使用 Illumina HiSeq进行转化和测序。由于“有毒”基因产物不会为细胞产生可行的重组质粒，因此基于这些有毒基因座的测序深度降低的负选择是可能的。实际上，可以从这些区域以低序列覆盖深度精确定位杀菌多肽（图2）。此外，由于窄谱靶标将是未来抗菌治疗的首选，所以应在多个宿主中测试已鉴定的抗菌噬菌体蛋白，以确定细菌靶标的毒性和保护范围。
一旦鉴定出抗菌噬菌体蛋白，它们就可以作为发现抗菌靶标的诱饵。这种细菌相互作用伙伴的识别仍然是一个关键问题。为此，可以使用不同的技术，包括质谱分析、酵母双杂交和基于基因组的筛选，重点是通过删除或过表达目标蛋白来消除毒性。迄今为止，最有希望的候选蛋白质包括那些影响宿主复制、转录和细胞分裂的蛋白质。
细菌靶向驱动筛选以鉴定噬菌体编码的抑制剂
与筛选过程从大规模基因组挖掘开始的噬菌体基因组驱动筛选方法不同，靶向驱动筛选使用宿主细胞中定义的必需蛋白质复合物作为诱饵，从噬菌体中剔除未知的相互作用伙伴。在Van den Bossche等人的早期研究中，选择参与铜绿假单胞菌代谢的必需蛋白质复合物作为诱饵，包括用于转录和基因组复制的RpoA、DnaN，用于转录调控的MvaT、Hfq，用于细胞分裂的FtsZ，用于脂肪酸生物合成的AcpP和用于能量维持的GlcB[6]。含有这些标记蛋白复合物的突变菌株被噬菌体感染后进行质谱分析，在该分析中确定了37个噬菌体相互作用伙伴，其中8个直接影响细菌生长。其他研究人员也使用类似方法从铜绿假单胞菌噬菌体中鉴定出一些与宿主生长、代谢相关的重要蛋白质。
模仿噬菌体蛋白的生长抑制作用 
被噬菌体多肽选择性抑制的细菌蛋白可能成为新的抗菌靶点，因为它们一旦被破坏后可能会影响一些基本过程并导致细菌生长迟缓。通过对抗菌机制的进一步表征以及相互作用位点的规范，以建立一种有效的方法来识别模拟噬菌体蛋白抗菌作用的小分子或抗菌肽。此外，实验方法应与结构和生物物理分析以及相互作用建模相结合，以能够直接设计针对已识别靶标的有效抑制剂。
研究人员使用高分辨率X射线晶体学、核磁共振和低温电子显微镜已经确定了少数靶向假定抗菌靶标的噬菌体蛋白的结构。例如，通过冷冻电镜对来自大肠杆菌噬菌体1的Gam和来自T7的Orc/Gp0.3的两种不同蛋白质进行结构表征。结果发现两者都模仿DNA，并可能被用于开发DNA结合蛋白抑制剂[7]。同样，通过X射线晶体学发现噬菌体phiKZ的Dip蛋白与RNA结合位点结合，这可能会激发RNA转运抑制剂的发现。使用核磁共振发现来自大肠杆菌噬菌体T7的Gp2蛋白被证明可以改变RNA聚合酶的构象，从而限制ssDNA进入活性位点，这种失活代表了另一种使细菌RNA聚合酶失活的机制[8]。除了设计适合活性位点口袋的小分子外，计算机模拟方法还能够优化化合物，提高它们的活性并计算它们的物理化学性质，从而增加成功通过后续临床前阶段的机会。
结论与展望  
作为细菌病原体的“捕食者”，毒性噬菌体在对抗抗生素耐药性发展的斗争中展现出巨大的潜力。大多数噬菌体只能感染一个物种内非常有限的细菌分离株，这种特异性源于长期的细菌-噬菌体进化。除了将噬菌体颗粒应用于感染部位的噬菌体疗法或溶素等基于酶的抗菌剂外，深入了解噬菌体劫持机制可以通过新的作用方式或设计新药发现现有抗菌药物的许多新靶点。值得注意的是，由于必须有特定的遗传工具以及跨学科技术较难整合等问题存在，所以这一研究领域在向其他新兴病原体扩展时仍面临挑战。然而，考虑到这些进化优化相互作用的高价值，与当前小分子筛选的随机性相比，这条扩展的研发管线可能值得实施。
最近出现的利用噬菌体的策略已经超越了它们最初的抗菌特性，转向了其他替代方法。除了直接杀死宿主外，还可以在噬菌体研究中探索抗毒剂。用这些化合物进行预处理可能会降低病原体的毒力，使这些细菌更容易被吞噬细胞吞噬和血清杀伤。由此，人体免疫系统成为噬菌体和细菌战场上必不可少的第三方。这个关键三角形成为开发可持续抗菌药物和了解人类与微生物组之间生物和进化动态平衡的关键。  
参考文献
1.Tyers, M. and G.D. Wright, Drug combinations: a strategy to extend the life of antibiotics in the 21st century. Nat Rev Microbiol, 2019. 17(3): p. 141-155.
2.Wan, X., et al., Phage-based target discovery and its exploitation towards novel antibacterial molecules. Curr Opin Biotechnol, 2021. 68: p. 1-7.
3.Al-Shayeb, B., et al., Clades of huge phages from across Earth's ecosystems. Nature, 2020. 578(7795): p. 425-431.
4.Li, T., et al., Isolation and Characterization of the Novel Phage JD032 and Global Transcriptomic Response during JD032 Infection of Clostridioides difficile Ribotype 078. mSystems, 2020. 5(3).
5.Yu, X., et al., Characterization and genomic study of "phiKMV-Like" phage PAXYB1 infecting Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 13068.
6.Van den Bossche, A., et al., Systematic identification of hypothetical bacteriophage proteins targeting key protein complexes of Pseudomonas aeruginosa. J Proteome Res, 2014. 13(10): p. 4446-56.
7.Wilkinson, M., et al., Structural basis for the inhibition of RecBCD by Gam and its synergistic antibacterial effect with quinolones. Elife, 2016. 5.
8.Sheppard, C., et al., A non-bacterial transcription factor inhibits bacterial transcription by a multipronged mechanism. RNA Biol, 2013. 10(4): p. 495-501.